Suomalaisia prekliinisiä liikehäiriötutkimuksia vuonna 2019

Hermokasvutekijät ja niihin liittyvät tutkimukset ja katsaukset (2019)

GDNF on hermokasvutekijä, jota on annosteltava suoraan aivoihin. Se toimii Parkinsonin taudin (PD:n) eläinmalleissa varsin hyvin, mutta potilaskokeet PD:ssa ovat antaneet vaihtelevia tuloksia, pääosin GDNF-hoito on ollut tehotonta. GDNF vaikuttaa sitoutumalla reseptoriinsa, joka on nimeltään RET (= REarranged during Transfection), ja sitoutuminen laukaisee joukon biokemiallisia reaktioita. Prof. Saarman ryhmä Helsingin yliopiston Biotekniikan Instituutista kehitti pari vuotta sitten pienmolekyylejä, jotka sitoutuvat RET-reseptoriin ja matkivat GDNF:n vaikutuksia. Nyt he ovat karakterisoineet yhtä perinteisten lääkeaineiden kaltaista yhdistettä, BT13, pääosin in vitro kokeissa, mutta myös koe-eläimillä. RET-aktivaatio voitiin osoittaa soluviljelmillä, mutta ei sellaisissa soluissa, jotka oli eristetty RET knock-out hiiristä. BT13 myös suojasi viljelmiä 6-OHDA:n ja MPP+:n myrkyllisyydeltä, jälleen edellyttäen RET:n läsnäoloa.

Eläinkokeissa BT13 annettiin hiirille laskimoon ja todettiin lisääntynyttä dopamiinin erittymistä striatumin mikrodialyysinesteeseen. Laskimoannostelun jälkeen BT13 pääsi aivoihin, jossa pitoisuudet ylittivät pitoisuudet plasmassa30 min ja 3 t kohdalla. BT13 on kuitenkin muutoin ominaisuuksiltaan hankala, huonoliukoinen ja lyhytvaikutteinen. Sen farmakokineettisiä ominaisuuksia pitää optimoida. Jo nyt vaikuttaa kuitenkin siltä, että BT13 on lupauksia antava prototyyppi, josta voi toivoa kehitettävän normaalien lääkeaineiden tapaan annosteltavia yhdisteitä. Tämä olisi merkittävä edistysaskel aivoinfuusioihin verrattuna. Nähtäväksi jää, tuleeko aivojen ulkopuolisista kudoksista odottamattomia haittoja. (1*).

Prof. Saarman ryhmä on myös kehittänyt hiiren, jolta puuttuu CDNF. CDNF on suomalais-virolainen keksintö, uuden tyyppinen hermokasvutekijä, joka eläinkokeissa on kutakuinkin saman tehoinen kuin GDNF, vaikka sen vaikutusmekanismi on erilainen. CDNF knock-out hiiret kasvavat ja lisääntyvät kuten verrokit. Vanhetessa ensimmäinen muutos on suolen limakalvonalaisen hermotuksen heikkeneminen. Vanhoillakin hiirillä substantia nigran (mustatumakkeen) dopamiinisolut ovat normaaleja sekä lukumäärältään että ulkonäöltään. Toiminnallisissa kokeissa on selkeää heikkoutta: amfetamiini ei vapauta normaaleja määriä dopamiinia eikä liikkumisvaste ole normaalin suuruinen. Tulkinta on, että CDNF-vajaat hiiret muistuttavat hyvin varhaisen vaiheen PD-potilaita. (2*).

Dos. Airavaaran ja dos. Voutilaisen ryhmä Helsingin yliopiston neurotieteen tutkimuskeskuksesta on tutkinut CDNF hermokasvutekijän kulkeutumista aivokudoksessa substantia nigraan antamisen jälkeen. Yllättäen CDNF ei kulkenut lainkaan eteenpäin kohti striatumia vaan jäi infuusiopaikan lähistölle. Tämä on erilainen tulos kuin se, kun CDNF infusoitiin striatumiin: tällöin se kulkeutui taaksepäin kohti substantia nigraa. (3).

Prof. Yliperttulan biofarmaseuttinen ryhmä on selvittänyt CDNF:n vapautumista ARPE-19 soluista (ihmisen retinan eli verkkokalvon pigmentin epiteelisolut), joita kasvatettiin yksikerroksisesti tai polymeeristen mikrokapseleiden sisällä. Ajatuksena oli kehittää ”valmiste”, josta CDNF:ää vapautuisi pitkään ja hallitusti esim. aivoihin ruiskuttamisen jälkeen. Vapautumista tapahtui, mutta merkittävästi vasta kun CDNF:stä poistettiin 4 viimeistä aminohappoa (KTEL), jotka kaiketi pitävät CDNF:ää lujasti kiinni solun sisäkalvoilla. Vielä ei tiedetä, toimiiko riisuttu CDNF normaalisti. (4).

Dos. Airavaaran ryhmä on laatinut 2 katsausta hermokasvutekijöiden (GDNF, CDNF, MANF) tutkimustilanteesta, erityisesti PD:n ja aivohalvauksen hoitoa ajatellen. Varsinaista uutta katsauksissa ei ole. (5, 6). Myös Sidorova ym. ovat kirjoittaneet katsauksen PD:n neuroregeneraatioon tähtäävän hoidon tilanteesta: proteiineista pienmolekyyleihin. Johtopäätös on pessimistinen, sillä PD potilailla mikään hoito ei ole toistaiseksi pelastanut dopamiinihermoja. (7*).

Edelleen Airavaaran ryhmä raportoi varoittavan esimerkin siitä, mitä ongelmia voi liittyä adeno-associated virus-  (AAV-) välitteiseen geeninsiirtoon. AAV:tä on käytetty eräänlaisena apuvälineenä sekä hermokasvutekijöiden että toksisten proteiinien geenien siirtämisessä aivoihin tuottamaan siellä jatkuvasti haluttua proteiinia. Tässä tutkimuksessa siirrettiin alfa-synukleiinin geeniä AAV-kuljettimella tarkoituksena indusoida alfa-synukleiinikertymiä hiiren aivoihin eli tuottaa PD:n hiirimalli. Malli näytti onnistuvan. Saatiin lieviä PD:n oireita ja dopamiinihermoissa olevan tyrosiinihydroksylaasin määrä ja aktiivisuus alenivat jonkin verran. Ongelma oli se, että pelkkä AAV tai AAV:ta ja tehottoman merkkiaineen geenin infusointi tuotti aivan saman tuloksen. Tyrosiniinhydroksylaasi aleni jopa enemmän kuin ”toksisen geenin” antamisen jälkeen. Tämä havainto pakottaa olemaan erityisen tarkka kontrolliryhmien kanssa, jotta johtopäätökset eivät olisi perusteettomia. (8).

Prolyylioligopeptidaasiin (POP, PEP, PREP) liittyvät tutkimukset (2019)

Dos. Myöhäsen ryhmän (Helsingin yliopiston farmasian tiedekunta, farmakologia) uusimpien väitöskirjojen (Svarcbahns, Julku) osatöistä viimeisimmät ovat ilmestyneet, ja niihin liittyviä katsauksia ja menetelmiä on julkaistu. Usean vuoden takaiset havainnot osoittivat PREP-estäjien vähentävän alfa-synukleiinin oligomeerien ja jopa sakkaumien määrää ja myös niiden muodostumista. Nämä osoitettiin aikanaan niin liuoksissa, soluviljelmissä että koe-eläinten aivoissa. Nyt on tutkittu tämän ilmeisen hyödyllisen liuotusvaikutuksen mekanismia. Uusi havainto on se, että PREP-estäjät aktivoivat autofagien toimintaa, joiden sisällä oligomeerit ja sakkakin pilkkoutuvat harmittomiksi tuotteiksi. Myöhäsen tutkimusten perusteella tätä toimintoa ajaa proteiinifosfataasi 2A:n aktivoituminen. PREP-esto ja PREP:n poistaminen (PREP knock-out) stimuloivat autofagiaa, PREP:in lisääminen inhiboi sitä. Vastaavat signalointireitit onnistuttiin varsin hyvin mittaamaan ja tulokset sopivat mainiosti yhteen. PREP tuntuisi siis olevan merkittävä säätelytekijä. Proteiinifosfataasi 2A on monessa mukana, joten PREP-estäjillä saattaa olla muitakin sovelluksia kuin PD. Ilmeisesti PREP-inhibitio sinänsä ei ole keskeistä (ks. alla). (9*).

PREP-eston voimakkuus ei  näyttänyt suoraan korreloivan autofagian aktiivisuuteen eli varsin heikotkin PREP-estäjät voivat stimuloida fosfataasi 2A:ta ja aktivoida autofagiaa. Tämä on todettu jo vanhoilla PREP-estäjillä, joita Myöhäsen Kuopion aikoina syntetisoitiin satoja ja nyt uusilla PREP-estäjillä. Näissä Wallenin ryhmän syntetisoimissa yhdisteissä ongelmallinen elektrofiilinen ryhmä on korvattu tetratsolilla. Tämän ryhmän sisällä heikotkin PREP-estäjät toimivat autofagian suhteen yhtä hyvin kuin vahvat. (10).

Mielenkiintoinen havainto saatiin Huntingtonin taudin solumallilla. PREP-estäjä esti polyQ:n aggregaatiota tehokkaasti (11). Liekö aggregaatiota estävä vaikutus lavennettavissa monenlaisiin sakkaumiin, ei vain alfa-synukleiiniin ja polyQ:hon?

Toinen Huntingtonin tautiin liittyä tutkimus on metodologinen. Työssä tutkittiin dopamiinireseptorien kuvantamista zQ175 delta neo KI (zQ175DN KI) Huntingtonin taudin hiirimallia, joka on suomalaisten toimesta aiemmin hyvin karakterisoitu. Dopamiinireseptoreiden toimintaa Huntingtonin taudissa on aiemmin kuvannettu [11C] raklopridilla, mutta [18F] fallypridilla on liki tuhatkertainen affiniteetti dopamiini D2/D3-reseptoriin, joten hiiren PET kuvauksen tarkkuus paranee ratkaisevasti. Tutkimuksessa kehitettiin parannettu [18F]fallypridin synteesimenetelmä. Sairaiden zQ175DN KI hiirien fenotyypin muutosta tutkittiin PET skannauksella uutta ligandia käyttäen 9–10 kk ja 12–13 kk iässä. Lopuksi mitattiin autoradiografialla D2/D3 reseptoreiden tiheydet striatumissa. Merkittävä aleneminen D2/D3 reseptoreihin sitoutumisessa havaittiin ajan funktiona. Matala sitoutuminen vahvistettiin autoradiografialla kokeen lopussa. Nämä tulokset vastaavat havaintoja Huntingtonin taudin muutoksista potilailla.  (12).

Itä-Suomen yliopistossa (FaT Aaro Jalkasen ryhmä) tutkittiin stressattuja soluviljelmiä. Tulehduksellinen stressi aiheutettiin LPS:llä (lipopolysakkaridi) tai gamma-interferonilla. Tällainen vaurio alensi PREP-aktiivisuutta mikrogliasolujen sisällä, mutta lisäsi sitä solujen ulkopuolella. PREP siis erittyi stressin aikana soluista ulos. Solunulkoinen PREP-nousu osoitettiin useilla menetelmillä. Selektiivinen PREP-estäjä KYP-2047 suojasi mikrogliaa kuolemalta ja vähensi tulehdustekijöitä. Tarjolla on siis kilpaileva vaikutusmekanismi PREP-estäjien hyödylliselle vaikutukselle PD:ssa? (13).

Myöhäsen ryhmä on karakterisoinut tehokasta PD-eläinmallia, jossa hiirillä on kaksi kriittistä mutaatiota alfa-synukleiinigeenissä (A30P ja A53T) samalla eläimellä. Tällainen kaksoismutaatio aiheuttaa havaittavia oireita jo 3 kk iästä alkaen, kun yksittäisten mutaatioiden vaikutus näkyy vasta vuoden ikäisillä hiirillä. Myös alfa-synukleiinin oligomeerit ja alentunut dopamiinitaso striatumissa näkyvät 3 kk iässä. Amfetamiinin aiheuttaman liikevasteen heikkous on havaittava liikemuutos. Epäilemättä tämä kaksoismutaatiomalli on toistaiseksi paras geenimalli PD-tutkimuksiin. (14).

Helsingin PREP-ryhmällä on myös omiin tuloksin pohjautuva katsaus-”commentary”. (15).

Muita tutkimuksia ja katsausartikkeleita (2019)

Dos. Domanskyin ryhmä Helsingin yliopiston Biotekniikan Instituutista on julkaissut 26-sivuisen yksityiskohtaisen ja kriittisen katsauksen oksidatiivisen stressin ja mikro-RNA:n yhteispelistä likipitäen kaikissa neurodegeneratiivisissa sairauksissa, mukaan lukien PD. Heidän pääviestinsä on se, että monimutkaisia asioita ei pitäisi liikaa yksinkertaistaa. (16*).

Hiljattain hiiren aivostimulaatiosta ja hermokasvutekijöistä väitellyt neurokirurgi Huotarinen Helsingistä (nyt Kuopion Neurokirurgian klinikalla) on jatkanut tutkimuslinjaansa selvittämällä aivostimulaation hoidon tehoon vaikuttavia keskeisiä parametrejä. Hyvään hoitovasteeseen pyrittäessä tarvitaan korkeita virtalukemia, joilla on lievä ja lyhytvaikutteinen dyskinesioita lisäävä vaikutus. Aiemmin suosittiin matalampia sähkövirtoja. (17).

FT Pekka Postila ja FT Tomasz Róg Jyväskylän ja Helsingin yliopistosta pohtivat katsauksessaan, miten hermosolujen lipidikoostumus ja sen muutokset ovat keskeisiä mm. PD:n synnyssä. (18).

Turkulainen kontribuutio prekliiniseen PD-tutkimukseen on esitellä seulontamenetelmä (F-NiB eli Fragment – and Negative image-based). Sitä on sovellettu fosfodiesteraasi 10A:n estäjien seulontaan. Kaikkiaan löydettiin 14 yhdsitettä, jotka estivät ko. entsyymiä pitoisuuksilla 27 – 67 uM (IC50). Inhibiittoreiden arvellaan olevan hyödyllisiä neuroprotektiossa ja psykoosilääkkeinä. (19).

Prof. Koistinahon ryhmän Itä-Suomen ja Helsingin yliopistoista syvälle menevä, perusteellinen 20-sivuinen katsaus valottaa solujen proteostaasin (valkuaisainetasapainon) merkitystä PD:ssa. Katsauksessa pyritään yhdistämään samaan pakettiin erilaisia näkökulmia aina proteiinin väärästä laskostumisesta, oksidatiiviseen stressiin ja alfa-synukleiinin sakkautumiseen. Myös PREP-estäjät on mainittu pitkässä hoitomahdollisuuksien listassa. (20*).

Saman ryhmän toinen perinpohjainen katsaus käsittelee aivojen tukisolukon yhden edustajan, astrosyyttien, luultua suurempaa merkitystä ja monimutkaisia vaikutuksia neurodegeneratiivisissa sairauksissa, joissa astrosyyttien toiminta on häiriintynyt. Hyväkuntoisille astrosyyteillä on osansa myös kantasoluhoitojen onnistumisessa. (21).

FaT Aaro Jalkasen (prof. Markus Forsbergin) ryhmä Itä-Suomen yliopistosta raportoi mahdollisesta rottamallista, jolla voisi tutkia PD:n unihäiriöitä. Striatumia vaurioitettiin osittain 6-OHDA:lla ja 5 viikon kuluttua tehtiin uretaaninukutuksessa toiminnallinen MRI-kuvantaminen. Vain vajaalla puolella rotista, sekä vale-leikatuilla että vaurioitetuilla, uretaanin aiheuttamat unimuutokset olivat osoitettavissa. Ero tuli esille muissa mittauksissa. 6-OHDA rotilla aivoalueiden välinen johtuvuus oli merkittävästi heikentynyt, toisin kuin  leikkaamattomilla tai vale-operoiduilla rotilla. (22).

Prof. Juha Partanen Helsingin yliopistosta on mukana laajassa (36 sivua) katsauksessa, joka käsittelee keskiaivojen dopamiinihermojen muodostumista sikiökehityksen aikana. Kehitystä säätelee 4 pääasiallista signalointijärjestelmää eri alueilla (floor plate, sonic hedgehog, wingles ja bone morphologic protein; nämä tuskin merkitsevät tavalliselle lukijalle mitään!). Samat järjestelmät ovat keskeisiä, kun halutaan tuottaa kantasoluista dopamiinisoluja. (23).

Helsingin yliopiston tutkijoita oli mukana tarttolaisen neurologin Pille Taban projektissa, jossa selvitettiin ”home-made” huumeen toksista vaikutusta, joka ilmenee L-dopa resistenttinä parkinsonismina. Huume on varsin suosittu ent. Neuvostoliiton osavaltioissa. Sitä on helppo valmistaa julkisen ohjeen mukaan pseudoefedriinistä ja kaliumpermanganaatista etikan avulla. Huume sisältää mm. mangaania ja metkatinonia (metcathinon), jotka molemmat ovat hermotoksisia. Tutkimuksessa yritettiin selvittää, kumpi komponentti on toksisuuden kannalta merkittävämpi ja onko vaikutus pre- vai postsynaptinen, ts. tuleeko vaikutus suorasta nigran dopamiinihermon vauriosta vai striatumin lyhyiden neuronien (GABAergiset, kolinergiset tai glutaminergiset neuronit) vauriosta. Hiirille annosteltiin joko mangaania, metkatinonia, ”home-made” seosta tai keittosuolaa 4 viikkoa 3 kertaa vuorokaudessa. Liikeaktiivisuutta ym. mitattiin viikoittain ja lopuksi tutkittiin aivoja histokemiallisesti, määritettiin useita hermomarkkereita ja tehtiin aivojen kuvantaminen (SPECT) Viikissä. Johtopäätös oli se, että molemmat komponentit ovat melko lailla yhtä toksisia ja vaikutus kohdistuu sekä dopamiinihermoihin (pääasiassa metkatinoni) että striatumin pikkuneuroneihin (pääasiassa mangaani). (24).

Loppusanat

Parkinsonin taudin prekliininen tutkimus on vuonna 2019 painottunut hermokasvutekijöihin ja PREP-entsyymin estäjiin. Muista liikehäiriöistä kiinnostusta on saanut vain Huntingtonin tauti. Myös kokeellisen tutkimuksen menetelmiin on kiinnitetty huomiota. Tutkijat ovat myös laatineet useita katsausartikkeleita, joiden merkitystä ei pidä aliarvioida. Niissä tutkija pakotetaan ottamaan kantaa omien tulostensa asemaan kaikkien alan tutkimustulosten joukossa. Kuten kliinisissä tutkimuksissa myös prekliinisissä töissä kansainvälinen yhteistyö on melkeinpä sääntö.

* Suomen Parkinson-Säätiö on tukenut tutkimusta.

• Avainsanat: astrosyytitCDNFhermokasvutekijätkantasoluhoitoParkinsonin tautiPREP-estäjäunihäiriöt