Suomalaisia Parkinsonin tautiin (PD) liittyviä prekliinisiä tutkimuksia 2020

Hermokasvutekijät ja niihin liittyvät tutkimukset ja katsaukset

GDNF on hermokasvutekijä, jota on annosteltava suoraan aivoihin. Se toimii Parkinsonin taudin (PD) eläinmalleissa varsin hyvin, mutta potilaskokeet PD:ssa ovat antaneet vaihtelevia tuloksia, pääosin GDNF-hoito on ollut tehotonta. GDNF vaikuttaa sitoutumalla reseptoriinsa, joka on nimeltään RET (= REarranged during Transfection), ja sitoutuminen laukaisee joukon biokemiallisia reaktioita solujen sisällä. Saman reseptorin kautta vaikuttavat myös neurturiini, artemiriini ja persetiini). CDNF:n vaikutusmekanismi on erilainen ja ilmeisen monimutkainen.

1.  CDNF-vajaat hiiret

CDNF on eläinkokeissa ollut sekä hermovauriolta suojaava että vaurioitunutta hermotusta parantava tekijä. Jotta sen periaatteellista tarpeellisuutta elintoiminnoissa voidaan arvioida, on tarpeellista tietää, kuinka eläimet pärjäävät ilman tätä valkuaisainetta. Asiaa tutkittiin HY:n Biotekniikan instituutissa (1*). Toisin kuin GDNF-vajaat hiiret, syntymästä CDNF-vajaat hiiret ovat elinkykyisiä, lisääntyvät ja elävät normaalin hiiren elämän. Merkittävin poikkeama on vähitellen kehittyvä koko suoliston limakalvon hermotuksen tuhoutuminen. Lihaskerros pysyy terveenä. Kyse ei ole perinteisestä apoptoottisesta kuolemasta vaan suorasta hermojen rappeutumisesta ja siitä seuraavasta kudosjätteen puhdistamisesta autofagian avulla. Yllättäen aivojen s. nigran dopamiinisolujen, dopamiinin ja sen metaboliittien määrät eivät muutu. Vasta hiirien vanhetessa dopaminerginen toiminta vähitellen hiipuu. Se ilmenee mm. lisääntyneenä dopamiinin vapautumisena ja amfetamiinin aiheuttaman liikkumisen kohentumisena. Dopamiinin kuljetusmekanismi myös häiriintyy. Kaiken kaikkiaan vanhenevien hiirien oirekuva muistuttaa PD:n varhaisvaihetta.

Toisen CDNF:ää muistuttavan kasvutekijän (MANF) geenin poisto hedelmöittymisestä saakka ei sekään aiheuttanut muutosta hiirien aivojen dopamiinijärjestelmässä (2*). Sen sijaan kaikki 3 UPR (Unfolded Protein Response; reaktio epänormaaleihin valkuaisaineisiin)-järjestelmää aktivoituivat. Tämä seurauksena haiman betasolut kuolivat.

2.  CDNF-vajaat zebrakalat (oikeammin cdnf)

Vastaavia geeninpoistotutkimuksia on tehty myös zebrakaloilla (3). Täydellinen cdnf-puutos (pienet kirjaimet) ei kaloillakaan johtanut dopamiinin puutostilaan aivoissa joitakin hermokimppuja lukuun ottamatta. Sen sijaan dopamiinihermojen lähellä olleet histamiinihermot kärsivät. Katekoliamiinien tuotannosta vastaava entsyymi tyrosiinihydroksylaasi lisääntyi. GABA-neuronien määrä romahti. Joitakin käyttäytymismuutoksia havaittiin: kalojen parveilu ja sosiaalinen kanssakäyminen köyhtyi. Herkkyys kouristuksiin lisääntyi. Näyttää siis siltä, että kaloissa cdnf-puutos aiheuttaa vähintään yhtä laajalti häiriöitä kuin hiirillä CDNF-puutos. Kummassakaan lajissa dopaminerginen häiriö ei ole päällimmäisenä esillä.

3.  Aivojen GDNF:n määrän hallittu kohottaminen kaksinkertaiseksi

Kuten alussa mainittiin, syntymästä saakka GDNF-vajaat hiiret eivät ole elinkelpoisia (mm. munuaiset eivät kehity). Myös liian suuri GDNF-määrä elimistössä ja aivoissa on haitallista. Hyvinkin suuria (100 – 1000 kertaa yli perustason) pitoisuuksia aivoissa voidaan tuottaa infusoimalla GDNF:ää suoraan aivoihin tai siirtämällä sitä aivoihin viruksen avulla. Tällaiset pitoisuudet lamaavat oman dopamiinijärjestelmän toiminnan, aiheuttavat ylikiihotusta ja dopamiinihermojen liiallista haaromista. Myös syöpien kehittymistä tapahtuu. Koska PD:n hoidossa GDNF:ää kuitenkin annostellaan, on paikallaan selvittää kohtuullisen GDNF-määrän turvallisuutta. Onkin kehitetty geneettinen hiirimalli, ns. hypermorfi, jossa GDNF-tuotanto suurin piirtein kaksinkertaistuu (4*). Hypermorfisilla hiirillä mitattiin lievästi kohonneita dopamiinitasoja striatumissa ja keskiaivoissa, kasvanut dopamiinin kuljetuskyky ja n. 15% nousu dopamiinihermojen ja hermopäätteiden lukumäärissä. Hiirille tehtiin 20 erilaista käyttäytymistutkimusta käyttäen mm. Intellicage-menetelmää. Vaikka hiirien liikesuoritukset paranivat hivenen, mitään erityistä ero kontrollihiiriin ei havaittu. Hiiret saivat kasvaa 17 – 19 kk ikään, jolloin ne lopetettiin ja tehtiin joukko histopatologisia ja kemiallisia analyysejä. Mitään epänormaalia ei havaittu. Erityisesti on mainittava, ettei tuumoreita tai syöpiä esiintynyt lainkaan.

4. GDNF-reseptorin (RET) pienimolekyyliset stimuloijat

Koska GDNF:n ja sen sukulaisproteiinien (neurturiini, artemiriini, persetiini) vaikutus solujen viestintään välittyy erityisen reseptorin, RET:in, kautta tavanomaisten lääkeaineiden kaltaisia yhdisteitä on etsitty ja löydetty. Etsinnän historiaa ja perusteita on laajasti kuvattu katsauksessa (5*). Ensimmäinen ”agonisti” (XIB4035) kuvattiin jo vuonna 2003, mutta positiivista vaikutuksistaan huolimatta sen vaikutus on epäsuora. Sittemmin seulontakokeissa on löytynyt useita yhdisteitä, joilla on suora RET:iä stimuloiva vaikutus eli ne ovat RET-agonisteja. Periaatteessa ne siis matkivat GDNF:n vaikutuksia. Tällaisia yhdisteitä ovat mm. BT13, BT18 ja BT44. Eläinkokeita tehtiin mm. neuropaattisen kivun hoidossa, jolloin havaittiin mm. annoksen optimoinnin tärkeys. Herkästi jouduttiin toksisiin annoksiin. Myös RET:in apureseptorin (GFRa)  kautta vaikuttavia yhdisteitä on löydetty. Saatavilla olevista yhdisteistä eniten on tutkittu BT13:ta, jolla on tehty kaksi ”proof of concept”- tyyppistä tutkimusta. Aine pääsee aivoihin ainakin suonensisäisen ruiskeen jälkeen.

Dopaminergisissä soluviljelmissä Biotekniikan Instituutissa Helsingissä havaittiin, että BT13 todella aktivoi RET:iä ja samoja solunsisäisiä signalointireittejä kuin GDNF. BT13 myös suojasi soluja 6-OHDA- ja MPP+-solumyrkyiltä. Harvoissa eläinkokeissa BT13 pääsi aivoihin ja pitoisuudet siellä ylittivät plasmassa olevat pitoisuudet. RET:in aktivointi ja signaalireitit voitiin todentaa myös aivoissa, mutta vaikutus oli heikompi kuin GDNF:llä. BT13 myös lisäsi mikrodialyysikokeissa dopamiinin vapautumista mikrodialyysikokeissa. Näyttää todella siltä, että BT13 matkii kohtuullisesti GDNF:n vaikutuksia, mutta sen teho ja lääkeominaisuudet jättävät tilaa paremmille yhdisteille (6*).

BT13-tutkimuksia on jatkettu HY farmasian tiedekunnan farmakologian ja lääkehoidon osastolla rottakokeilla 6-OHDA PD pyörimismallissa (7*). Kahta BT13 annosta (0.25 ja 0.5 mg/ml) verrattiin GDNF:ään (0.25 mg/ml), joita kaikkia annettiin toiseen striatumiin minipumpun avulla viikon ajan alkaen juuri ennen toksiinin injektiota lähelle toista s. nigraa. Rottia seurattiin 6 viikkoa ja amfetamiinilla aiheutetut kiertoliikkeet rekisteröitiin 2, 4 ja 6 viikon kohdalla. Lopuksi aivot otettiin talteen ja tutkittiin monipuolisesti. Koska BT13 on vaikealiukoinen kaikki fysiologisiin liuoksiin, se liuotettiin propyleeniglykoliin. Tätä liuotinta annettiin yhdelle lisäkontrolliryhmälle. BT13 infuusiot aivan ilmeisesti vähensivät pyörimiskäyttäytymistä, mutta esim. GDNF:n vaikutus ei ollut kovin vakuuttava. Liuottimen epäfysiologisuus haittasi tulkintaa. Biokemiallisissa ja histokemiallisissa analyyseissä BT13:n, kuten myös GDNF:n dopamiinisoluja suojaava vaikutus oli vaatimaton, jos sitäkään. GDNF, mutta ei BT13, paransi hiukan dopamiinin kuljetusta. Tämä tutkimus jättää paljon toivomisen varaa jatkotutkimuksilta.

Katsausartikkelissa (8*) on laajemmin käsitelty GDNF:n ja RET-reseptoriagonistien ominaisuuksia ja eroja. Useita muitakin katsauksia on ilmestynyt vuonna 2020 (9*, 10, 11). Optimismi kulkee jossain määrin realismin edellä. Jopa siitä keskustellaan, voidaanko PD parantaa hermokasvutekijöillä, miten voidaan parantaa nykyisten hermokasvutekijöiden ominaisuuksia ja pohditaan myös miksi hyviä tuloksia eläinkokeissa ei oikein millään voida toistaa kliinisissä potilastutkimuksissa.

5.  Lewyn kappaleiden patologia estyy GDNF/RET reittiä aktivoimalla

Yksi vuoden 2020 merkittävistä kokeellisista töistä on kansainvälisen tutkimusryhmän, pääosassa Biotekniikan Instituutin tutkijat, tekemä, jossa väärin laskostuneen a-synukleiini (aSyn)-proteiinia sisältävien säikeiden kertymistä dopamiinisoluihin tutkittiin soluviljelmissä ja hiirien aivoissa. Aiemmin on arveltu tai oikeammin luultu, ettei GDNF toimi aSyn-PD-mallissa lainkaan. Nyt osoitettiin, että GDNF:n lisääminen viljelmiin tai infusointi hiiren striatumiin estivät tehokkaasti aSyn säikeiden kertymisen ja saostumisen solujen sisään eli Lewyn kappaleiden muodostumisen. Tehoa ei saatu, jos RET oli poistettu tai RET:n solunsisäiset signaalireitit oli estetty (12).

Prolyylioligopeptidaasiin (POP, PEP, PREP) liittyvät tutkimukset

Usean vuoden takaiset havainnot Helsingin yliopistosta (dos. Myöhäsen ryhmä) osoittivat PREP-estäjien vähentävän aSyn oligomeerien ja jopa sakkaumien määrää ja myös niiden muodostumista. Nämä osoitettiin aikanaan niin liuoksissa, soluviljelmissä että koe-eläinten aivoissa. Nyt on tutkittu tämän ilmeisen hyödyllisen liuotusvaikutuksen mekanismia (13*). Uusi havainto on se, että PREP-estäjät aktivoivat autofagien toimintaa, joiden sisällä oligomeerit ja sakkakin pilkkoutuvat harmittomiksi tuotteiksi. Tutkimusten perusteella tätä toimintoa ajaa proteiinifosfataasi 2A:n aktivoituminen. PREP-esto ja PREP:n poistaminen (PREP knock-out) stimuloivat autofagiaa, PREP:in lisääminen inhiboi sitä. Vastaavat signalointireitit onnistuttiin varsin hyvin mittaamaan ja tulokset sopivat mainiosti yhteen. PREP tuntuisi siis olevan merkittävä säätelytekijä. Proteiinifosfataasi 2A on monessa mukana, joten PREP-estäjillä saattaa olla muitakin sovelluksia kuin PD. Ilmeisesti PREP-inhibitio sinänsä ei ole keskeistä. Asian varmistamiseksi Kilpeläinen ym. (14) tutki 12 PREP-estäjää, joiden estovaikutus oli hyvin erilainen (IC50 0.2 – 1010 nM). Useilla menetelmillä voitiin osoittaa, ettei PREP-esto lainkaan korreloinut autofagiaan eli aSyn polymeerien tai sakkautumien liuotukseen. PREP-estäjät muuttavat ilmeisesti PREP-entsyymin muotoa tai toimintaa muulla mekanismilla.

Rostami ym. (15) tutki monen laboration yhteistyönä PREP-estäjien vaikutuksia hermosolujen kaltaisissa SH-SY5Y soluissa ja astrosyyteissä (tukisoluja, joissa ei ole PREP-entsyymiä). Soluja altistettiin aSyn säikeille, joita kerääntyi molempiin solutyyppeihin. PREP-estäjä KYP-2047 estä tätä kertymistä vain hermoperäisissä soluissa. Niissä myös havaittiin autofagian merkkiaineiden relevantteja muutoksia.

Huntingtonin tautiin (HD) liittyvät tutkimukset

Itä-Suomen yliopistossa ja Charles River Discovery Services keskuksessa on tutkittu kahta geneettistä HD:n hiirimallia (R6/2 ja Q175), joissa esiintyy taudille tyypillisiä CAG-toistojaksoja (16). Hiiristä tutkittiin peräti 79 liikeparametriä. Menetelmä oli kinemaattinen eli eläimiä seurattiin supernopealla videokameralla, joka otti 300 kuvaa/s. Kontrollihiiriin verrattuna ensimmäisiä muutoksia nähtiin jo ensimmäisen elinkuukauden lopulla. Testi kehitettiin seulontaa varten ja se on todella nopea vaatien vain 30 s hiirtä kohti. Suurtenkin lääkeainekandidaattien seulonta on siten mahdollista. Puutetta taitaa lähinnä olla juuri yhdisteistä.

Helsingin yliopiston Biotekniikan Instituutin hoitokokeessa HD:n malli indusoitiin kinoliinihapolla, jolla altistettiin striatumin soluviljelmiä tai ainetta annettiin rottien striatumiin (17). Kinoliinihappo on aivoissa esiintyvä aine, jonka määrä nousee jopa nelinkertaiseksi ihmisen HD:ssa. Kaksi viikkoa myöhemmin striatumiin infusoitiin CDNF:ää annoksilla, jotka ovat olleet tehokkaita PD:n rottamallissa. Sekä soluviljelmissä että rotilla CDNF:llä kinoliinihapon toksisuus aleni. Rottien käyttäytymisessä se näkyi mm. parantuneen suoriutumisessa pyörivällä sauvalla ja tassujen otteen vahvistumisena. Myös ataktinen kävely helpottui. Vaikka CDNF:n vaikutus oli varsin vaatimaton ja rotilla ilmeisen ohimenevä, CDNF näyttäisi olevan harvinainen mahdollisuus puuttua taudin kulkuun edes jossain määrin.

Muita tutkimuksia (lyhyesti)

PD:n hermovaurion syitä on etsitty myös aivojen tukisolujen (astrosyytit, gliasolut) vauriosta tai huonosta toiminnasta (18*). Itä-Suomen yliopiston AIV-instituutin tutkijoilla on omanlaisensa lähestymistapa asiaan. PD-potilailta on eristetty kantasoluja ja niistä on kasvatettu astrosyyttejä. Näissä havaittiin samanlaisia muutoksia kuin hermosoluissa, esim. aSyn-sakkaumia. Lisäksi nähtiin vakavia muutoksia rasva-aineenvaihdunnassa. Aivojen gliasoluissa havaittiin lisääntyneen tulehduksen merkkejä. Tätä on tarkemmin raportoitu erikseen (19). On siis ilmeistä, että myös aivojen tukisoluilla on ajateltua suurempi merkitys PD:n synnyssä. Hoidon suhteen tällä tiedolla ei toistaiseksi ole sovellutuksia tiedossa.

Tulehduksen ja proteostaasin (aivojen valkuaisaineiden normaalin toiminnan) häiriöitä on käsitelty perusteellisessa katsausartikkelissa (20), joka on ikään kuin edellä kuvattujen julkaisujen pidennetty pohdinta- ja keskusteluosio.

Netriini-1 on aivojen valkuaisaine, jota on erityisen runsaasti s. nigrassa. Jasmin ym. (21) HY Biotekniikan instituutista osoittivat, että netriini-1 vajavaiset hiiret saavat s.  nigran vaurion ja dopamiinipuutoksen. Tämä näkyy myös liikkumisen häiriönä. PD:n hiiri- ja rottamalleissa netriini-1 antaminen striatumiin tai sen yli-ilmentäminen parantaa vaurioita. Myös PD-potilaiden aivoista on mitattu matalia netriini-1 pitoisuuksia. Netriini-1 ja sen reseptorit voivat hyvinkin olla yksi uusista avauksista PD:n lääkehoidon kehitysrintamalla.

Aivojen histamiinin on jo kauan tiedetty vaikuttavat aivojen dopamiinitoimintaan säätelemällä dopamiinin vapautumista hermonpäätteistä. Koski ym. (22*) HY Biomedicumista tutkivat asiaa poistogeenisillä hiirillä, jotka olivat histamiinivapaita. Hiirille tehtiin tavanomainen 6-OHDA vaurio ja tutkittiin reagointia amfetamiinille ja L-dopalle. Amfetamiinin aiheuttama kiertoliike aleni histamiinipuutteisilla, mutta L-dopan vaste säilyi. Histamiinin puutos vahvisti laaja-alaisesti dopamiinitoimintaa aivoissa.

Minnesotassa työskentelevä Lehto (23) ja AIV-instituutin tutkijat tutkivat tarkasti suunnatun aivostimulaation eli orientaatioselektiivisen (OS-DBS) vaikutusta subtalaamiseen tumakkeeseen. Menetelmä näyttäisi parantavan DBS:n joustavuutta ja antavan varmemman tuloksen kuin perinteinen DBS.

Lei ym. HY Biomedicumista (24) selvitti rotan PD 6-OHDA mallissa kivun lievittymistä käyttäen erityistä kuumennettua (43oC) neulaa lihasstimulaatiossa. Neula helpotti kipua mutta esti myös apomorfiinilla aiheutettua kiertoliikettä. Tällainen hoitotapa voi olla hyödyllinen varhaisessa PD:ssa.

Yan ym. (25) esittävät katsausartikkelissaan, että aSyn- ja tau-valkuaisaineiden interaktio monissa aivosairauksissa lienee paljon yleisempi kuin luullaan. Periaatteessa on ajateltu, että aSyn-sakka liittyy nimenomaan PD:iin ja tau-sakka Alzheimerin tautiin.

Postila ja Rog Jyväskylän yliopistosta ja HT fysiikan laitokselta hakevat katsauksessaan syitä PD:iin mm. lipidikalvojen ja dopamiinin poikkeavasta vuorovaikutuksesta (26).

Myös Sciacca ym.  (27) HY, fysiikan laitos) ovat laatineet katsauksen lipidi-chaperoni (”paimen”) hypoteesistä. Solukalvojen rasvojen häiriön aiheuttajana voivat olla mm. väärin laskostuneet tai muuten epänormaalit valkuaisaineet. Näitähän ovat mm. amyloidit eli amyliini, beta-amyloidi ja aSyn.

Amyloidipolymerisaatiota (monistusta) aivosairauksien syynä on käsitellyt myös Malmberg ym. (AIV-instituutista mukana Tarja Malm; 28) katsaus. He ehdottavat, että erilaiset nukleaatioreitit voivat johtaa erityyppisiin amyloiditauteihin, siis sokeritautiin, Alzheimerin tautiin ja PD:iin.

Nanopartikkelit ovat kuuma tutkimusaihe. Gupta ym. (29) Tampereen yliopistosta ovat osoittaneet kobolttia sisältävien nanopartikkeleiden toksisuuden ihmisen hermosoluviljelmillä. Niiden antaminen voi siis aiheuttaa hermotuhoa. Sitä voidaan estää N-asetyylikysteiinillä ja lipidi-peroksidaasin salpaajilla. Vismuttia sisältävät partikkelit eivät ole yhtä toksisia.

Puris ym. (30) Itä-Suomen yliopistosta ovat laatineet katsauksen L-tyypin aminohappokuljettimen käytöstä lääkeaineiden annostelussa ja erityisesti aivoihin suunnatussa lääkehoidossa. Käsiin jäi vain L-dopa, joka käyttää tätä kuljetusmekanismia ainakin pääosin.

Farmakognosiaan on perehtynyt Tienaho ym. (31). Ryhmässä on mukana tutkijoita Tampereen ja Helsingin yliopistoista sekä useista muista maista. He ovat etsineet uusia lääkeaineaihioita harvinaisen männyn juuristosta. Tehtyjä vesiuutteita on seulottu monilla soluviljelymalleilla, mm. hermosoluilla ja vaikutuksia on havaittu. Kaikkiaan 330 yhdisteen joukossa oli 177, joilla oli jokin biologinen vaikutus. Vahvaa näyttöä varsinaisista PD-lääkkeistä ei vielä saatu.

Menetelmien kehittämistä ja kuvaamista

Prekliininen PD-tutkimus vaatii monimutkaisia menetelmiä ja uusiakin kehitetään. On tullut jo tavaksi saattaa hyviä ja koeteltuja menetelmiä myös julkaisumuotoon. Seuraavassa muutamia esimerkkejä.

Er ym. (32*) (HY Biotekniikan instituutti) kuvaa uuden PD:n soluviljelymallin, jossa dopamiini-solujen vaurio aiheutetaan etukäteen valmistetuilla aSyn-säikeillä. Koko menetelmä kaikkine työvaiheen on julkaisu vapaasti saatavilla olevana videona.

Siderova ja Domanskyi (33*) kuvaavat, miten oksidatiivista stressiä voidaan mitata merkkianetta, malonidialdehydiä, analysoimalla.

Airavaara ym. (34) ovat laatineet todella kattavan katsauksen kuta kuinkin kaikista PD:n eläin- ja solumalleista. Toksiinit, geneettiset hiirimallit, viruskuljettajien käyttö ja soluviljelymallit analysoidaan kriittisesti.

Myös Koistinahon/Lehtosen ryhmällä (19, 20) on menetelmätietämystä siitä, miten mm. PD-potilaiden kantasoluista voidaan tuottaa tarpeen mukaan dopamiinisoluja tai tukisoluja, joihin sairauden merkit ovat jääneet näkyviin.

Loppupäätelmiä

Covid-19 pandemiasta huolimatta Parkinsonin tautiin liittyvä tutkimus on jatkunut varsin vilkkaana. Kongressimatkailu on ollut jäissä, mutta internetkokoukset ovat kehittyneet varsin siedettäviksi. Suomessa prekliinisen tutkimuksen painopiste on Helsingin yliopiston Viikin kampuksella, jossa erityisesti Biotekniikan instituutti ja farmasian tiedekunnan farmakologian ja lääkehoidon osasto tekevät hedelmällistä yhteistyötä hermokasvutekijöiden parissa. On miellyttävä huomata, miten Viikin alueen tutkimus etenee ja hakee uusia reittejä kaiken aikaa. Osa yhdisteistä on jo kliinisissä kokeissa ja toisaalta muutamat ideat ovat jo kehittymässä lääke-kehitysaihioiksi. Kannattaa myös mainita, että farmakologian professorikunnassa on menossa sukupolvenvaihdos. Viikin farmasiaan on jo tullut peräti kaksi hermokasvutekijöistä meritoitunutta professoria/apulaisprofessoria. Itä-Suomen yliopistokin on rekrytoimassa PD-tutkijaa professoriksi. Helsingin ulkopuolella kokeellista tutkimusta on ollut myös Kuopiossa, Oulussa, Tampereella ja jopa Jyväskylässä, mutta enemmänkin voisi olla.

Suomen Parkinson-Säätiö on tukenut tekstin referaateissa *:llä merkittyjä tutkimuksia.

• Avainsanat: aivojen tukisoluCDNFGDNFhermokasvutekijätHuntingtonin tautiLewyn kappale -tautiprekliininen tutkimusPREP-estäjä